NMR

NMR (Nucleaire Magnetische Resonantie) wordt gebruikt als een standaard analysemethode voor structurele bepaling van een organische verbinding. In NMR-analyse komt de verhouding van het aantal atoomkernen in een verbinding overeen met de verhouding van de oppervlakten van de pieken in het spectrum.

Een monster en een standaard (een interne standaard) met een bekende zuiverheid worden gemengd en opgelost in een gedeutereerd oplosmiddel. Een kwantitatieve waarde van de zuiverheid van het monster kan worden berekend op basis van de verhouding tussen het oppervlak van de spectrale pieken die afkomstig zijn van het monster en de standaard, het aantal protonen, de massa's en de moleculaire gewichten van het monster en de standaard.

Productcategorieën

NMR standaarden

Merck Supelco biedt een set NIST SRM traceerbare gecertificeerde referentiematerialen voor gebruik als interne standaard in kwantitatieve NMR-studies. Het aanbod omvat qNMR-standaarden voor 1H, 31P en 19F NMR experimenten.

FAQ

Nucleaire magnetische resonantie (NMR) is een spectroscopische techniek die kan worden gebruikt om structurele en dynamische eigenschappen van moleculen te triggeren door gebruik te maken van het gedrag van bepaalde atomen wanneer deze in zeer krachtige supergeleidende magneten worden geplaatst (180 000 tot 360 000 keer sterker dan het aardmagnetisch veld voor magneten bij UConn Health). Wanneer NMR-actieve kernen in een sterk magnetisch veld worden geplaatst, richten ze zich op het veld en beginnen ze te reageren met een frequentie die afhankelijk is van de gyromagnetische ratio van de isotopen en de sterkte van het toegepaste magnetische veld, samen met de chemische en fysische omgeving van het atoom. De component van de frequentie die afhankelijk is van de chemische en fysieke omgeving wordt de chemische verschuiving genoemd. NMR experimenten verstoren de uitlijning door het toepassen van korte pulsen van Radiofrequentie (RF) energie om de chemische verschuiving van elk van de NMR actieve atomen in het bestudeerde molecuul te bepalen. Door gebruik te maken van combinaties van pulsen en vertragingen (dit wordt een pulssequentie genoemd) kan aanvullende informatie worden verkregen, zoals welke atomen aan elkaar zijn gebonden en welke atomen ruimtelijk dicht bij elkaar liggen. Door gebruik te maken van veel verschillende onderzoeken is het mogelijk om de driedimensionale structuur van moleculen, waaronder grote biomoleculen zoals eiwitten, te bepalen.

Hoge resolutie NMR-onderzoeken zijn beter uitvoerbaar voor eiwitten van minder dan ongeveer 25 kDa in massa en oplosbaar tot ongeveer 0,5 mM. In bepaalde gevallen kan het mogelijk zijn om eiwitten of complexen van grotere omvang of lagere oplosbaarheid te onderzoeken. Membraan-eiwitten zijn moeilijk te bestuderen met behulp van hoge resolutie methoden, maar er worden nieuwe technieken ontwikkeld die wellicht toepasbaar zijn. Omdat NMR-studies meestal labeling vereisen, moet het eiwit met stabiele isotopen 15N, 13C, en soms 2H (een expressiesysteem dat geschikt is voor groei in gelabelde media), beschikbaar zijn. Eiwitten moeten worden gezuiverd (meestal >95% is vereist), gevouwen en ten minste marginaal stabiel zijn. Voorafgaande karakterisering door circulair dichroïsme en thermische denaturatie of door middel van oplosmiddelen wordt aanbevolen.

Deze vraag is moeilijk te beantwoorden, omdat ze afhankelijk is van de vragen die gesteld worden en het gedrag van het monster. Doorgaans is 300 µl (met gespecialiseerde NMR-buizen) tot 600 µl monster nodig. Eiwitconcentraties voor goed functionerende systemen moeten hoger zijn dan 150 µM voor structuurstudies, maar lagere concentraties kunnen worden gebruikt voor andere dan structuurstudies. Hoewel 150 µM een ruwe schatting is voor de laagste concentratie om te gebruiken voor structuurstudies, is het raadzaam om de eiwitconcentraties zo hoog mogelijk te maken en deze te laten beperken door de oplosbaarheid en het eiwitgedrag, niet door de hoeveelheid geprepareerd eiwit. De hoeveelheid tijd die wordt gebruikt voor het uitvoeren van langere experimenten om te compenseren voor lage concentraties, en de toegenomen tijd om NMR-spectra te interpreteren, zal vrijwel zeker langer zijn dan de tijd die nodig is om een extra monster voor te bereiden.

Zodra het monster voldoende is gezuiverd en gedroogd, is de volgende stap het kiezen van een geschikt oplosmiddel. Aangezien deuterium veruit de meest populaire "slotkern" is, wordt het monster meestal opgelost in een gedeutereerd oplosmiddel (een gedeutereerd oplosmiddel is een oplosmiddel waarin een groot deel, meestal meer dan 99%, van de waterstofatomen is vervangen door deuterium). Veelgebruikte gedeutereerde oplosmiddelen zijn aceton-d6, benzeen-d6 en chloroform-d, hoewel er veel andere oplosmiddelen beschikbaar zijn.

Factoren waarmee rekening moet worden gehouden bij de keuze van een oplosmiddel zijn:

1. Oplosbaarheid:

  • Het is duidelijk dat hoe beter het monster oplosbaar is, des te beter het is. Dit maximaliseert de hoeveelheid monster binnen het gevoelige volume waardoor de gevoeligheid van het onderzoek toeneemt. Een hoge oplosbaarheid is vooral belangrijk als er slechts kleine hoeveelheden van het monster beschikbaar zijn.

2. Interferentie van signalen van oplosmiddelen met het monsterspectrum

  • Het oplosmiddel zelf zal onvermijdelijk NMR-signalen produceren die gebieden van het spectrum zullen vertroebelen. Deze 'restoplosmiddelpieken' mogen niet overlappen met signalen van het monster.

3. Temperatuursafhankelijkheid:

  • Voor experimenten boven of onder kamertemperatuur zijn smelt- en kookpunten van een oplosmiddel ook belangrijke factoren. Bovendien zal de oplosbaarheid van het monster waarschijnlijk variëren met de temperatuur.

4. Viscositeit:

  • Hoe lager de viscositeit van het oplosmiddel, hoe beter de resolutie van het onderzoek.

5. Kosten:

  • Het is duidelijk dat voor routinematige NMR, waarbij veel monsters moeten worden gemeten, de kosten van het oplosmiddel een belangrijke overweging is. Als vuistregel geldt dat de prijs stijgt met het aantal gedeutereerde atomen.

6. Watergehalte:

  • Bijna alle NMR oplosmiddelen bevatten sporen van water. Ook zijn velen hygroscopisch (ze absorberen water uit de atmosfeer) en dus bevatten ze meer water naarmate ze langer worden opgeslagen. De aanwezigheid van een water (HDO) piek zal alleen dienen om de kwaliteit van de NMR spectra te degraderen. Het watergehalte in het oplosmiddel kan sterk worden verlaagd met behulp van filtratie door een droogmiddel of door het oplosmiddel op te slaan over moleculaire zeven.
  • De keuze van het oplosmiddel voor een bepaald monster zal het beste compromis zijn tussen de verschillende voor- en nadelen ervan. Voor exacte details van specifieke oplosmiddelen wordt verwezen naar de standaard NMR-tekst.